生物醫(yī)學(xué)科研工作者的科研基本離不開抗體，WB（western blot）,IP(immunoprecipitation), IHC(immunohistochemical 免疫組化),IF(immunofluorescence 免疫熒光),ChIP(Chromatin immunoprecipitation)，FC(flowcytometry 流式細(xì)胞) 都需要用到抗體，那么這幾種實(shí)驗(yàn)方法中的抗體有什么區(qū)別呢？

我們在CST上面找p53的抗體，得到了如下的頁面

可以看出p53抗體有很多種，并且每種抗體能做的實(shí)驗(yàn)還都不一樣，那么為什么不同的抗體能做的實(shí)驗(yàn)不一樣呢？這要從抗體是如何制備的開始。

1. 如何才能成為一個(gè)優(yōu)秀的抗原？

制備抗體之前最重要的是如何制備抗原。一個(gè)良好即優(yōu)秀的抗原應(yīng)該具備的素質(zhì)是

a. 分子足夠大。 我們知道抗原與抗原之間的區(qū)別是由抗原決定族決定的，抗原決定族又叫做表位（epitope），這些表位通常是由6-8個(gè)氨基酸組成的。而且要5-10kD才有一個(gè)表位，所以一些分子量太小的蛋白質(zhì)或者多肽很難有一個(gè)表位的，也很難作為一個(gè)合格優(yōu)秀的抗原。注意表位有兩種形式，一種是線性表位，即由氨基酸的序列決定的。另外一種是構(gòu)象表位，是由氨基酸的空間結(jié)構(gòu)決定的。兩個(gè)相隔很遠(yuǎn)的氨基酸序列在空間結(jié)構(gòu)上靠在一起可以形成一個(gè)結(jié)構(gòu)表位。

b. 外源性強(qiáng)。我們常常將抗原注射到動(dòng)物內(nèi)體得到抗體，因此抗原必須要與該動(dòng)物體內(nèi)的成分區(qū)別性大，因?yàn)閯?dòng)物對(duì)自身的物質(zhì)形成了免疫耐受，如果抗原與動(dòng)物自身的物質(zhì)非常相似，則很難引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，也很難得到好的抗體。

c. 結(jié)構(gòu)盡量復(fù)雜。有些物質(zhì)即使分子量很大也不能算是一個(gè)合格的抗原，比如明膠分子量特別大，也屬于外源性強(qiáng)的物質(zhì)。但是明膠的氨基酸基本上是直鏈的氨基酸，在體內(nèi)容易被降解，類似的淀粉、核酸、多聚賴氨酸也是一樣，不是一個(gè)合格的抗原。

2. 制備抗體中常用獲得抗原的方式有哪些？

a. 人工合成多肽。很多家族蛋白相似度很高，比如actin家族中 a-actin, b-actin, r-actin三者之間非常相似，基本上只差幾個(gè)氨基酸，而這些差別的氨基酸往往還被包裹在內(nèi)部。因此只有人工合成這些差別的序列多肽，才可能區(qū)分開這三種相似的蛋白質(zhì)。制備出來的抗體大部分是識(shí)別線性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。

b. 純化的重組蛋白。重組蛋白比較容易獲得，而且能夠獲得比較高的純度。但是在重組蛋白中我們?yōu)榱思兓尤胍欢螛?biāo)簽（比如GST， His, Flag等），拿這些帶有標(biāo)簽的重組蛋白去免疫動(dòng)物，自然也會(huì)得到對(duì)標(biāo)簽識(shí)別的抗體。我們常常用His作為標(biāo)簽，因?yàn)樗容^小，而且免疫原性比較弱，產(chǎn)生的抗體可以忽略。制備的抗體可以識(shí)別線性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，也可以識(shí)別天然折疊狀態(tài)下的蛋白質(zhì)。

c. 純化的天然蛋白。天然蛋白存在修飾，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此是用來做抗體zui 好的抗原。但是很遺憾天然蛋白很難達(dá)到較高的純度。制備出來的抗體*是識(shí)別天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，對(duì)線性結(jié)構(gòu)的也能識(shí)別。

3. WB，IP，IHC，IF，ChIP，FC之間對(duì)抗體需求有什么區(qū)別？

在理解上面技術(shù)對(duì)抗體需求的區(qū)別之前我們首先要知道這些實(shí)驗(yàn)技術(shù)都需要什么樣的抗體。

a. WB. WB的蛋白經(jīng)過加熱變性之后都變成線性的結(jié)構(gòu)。因此zui 好的抗體是采用非常特異序列的人工合成多肽的方法來做實(shí)驗(yàn)，結(jié)果也非常特異。

b. IP/CHIP. 我們用抗體去結(jié)合生理狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，因此IP的抗體最好使用純化的天然蛋白制作的抗體來做，也可以用純化的重組蛋白的抗體。最好不要用人工合成多肽制作的抗體，因?yàn)檫@種抗體識(shí)別的位點(diǎn)可能被深深地藏在了蛋白的內(nèi)心深處。CHIP和IP沒有太大的區(qū)別，wei一的問題在于，如果抗體識(shí)別的表位和該蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的部位一致，則會(huì)導(dǎo)致CHIP實(shí)驗(yàn)的失敗。

c. IF/IHC. 免疫熒光和免疫組化中需要進(jìn)行固定一步，固定是為了盡量讓細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)維持和原有的一致。這種化學(xué)物質(zhì)的固定使蛋白質(zhì)變性凝固，與天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)有了一定的區(qū)別，但是又不同WB中加熱變性變成了線性的結(jié)構(gòu)。因此在做IF/IHC實(shí)驗(yàn)中，最合適的抗體可以是純化的重組蛋白得到的抗體，也可以是人工合成多肽得到的抗體（多肽是在蛋白質(zhì)的表面）

d. FC. 流式細(xì)胞中分為兩種，一種是活細(xì)胞的流式，這種流失最好采用是天然蛋白或者重組蛋白的抗體來做，另外一種是經(jīng)過固定之后的流式，和IF/IHC 所用抗體一致。 在做流式細(xì)胞中，我們有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記，間接標(biāo)記不如直接標(biāo)記真實(shí)準(zhǔn)確。因此我們選擇流式抗體要采用帶有熒光標(biāo)記的抗體；如果研究的蛋白沒有直接標(biāo)記的抗體，那么就采用間接標(biāo)記抗體，需要添加熒光二抗。

4. 常見的問題

a. 做流式的抗體和免疫組化的抗體是一樣的嗎？

不一定能通用。流式是用直接標(biāo)記還是間接標(biāo)記？如果是直接標(biāo)記的話，那這個(gè)抗體一般不是FITC標(biāo)記或者就是TRITC，PE之類的。如果恰好你的免疫組化，也是想用熒光素標(biāo)記的抗體來直接標(biāo)記，那就可以通用。如果你的免疫組化要用其它的標(biāo)記的話，或者是間接標(biāo)記的話，就有麻煩，因?yàn)闊晒馑氐臉?biāo)記很可能會(huì)影響二抗和一抗的結(jié)合。

b. 為什么我的抗體做WB非常好，而做不了IF，IHC等其他任何實(shí)驗(yàn)？

首先恭喜你有一個(gè)WB非常好的抗體，畢竟能獲得做WB非常好的抗體也不容易。其次，你這個(gè)抗體很可能是通過人工合成多肽得到的，和上面所述，你用來做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白質(zhì)的中心，因此只能識(shí)別WB中線性的部分。

c. 如何選擇免疫組化抗體？

首先，一抗是選擇單克隆抗體還是多克隆抗體，單克隆抗體特異性強(qiáng)，靈敏度低；多克隆抗體靈敏度高，特異性弱。根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果非特異多，那么選擇單克隆抗體；如果陽性信號(hào)弱，不妨選擇多克隆抗體試試。一般家兔來源的都是多克隆，小鼠來源的是單克隆。其次是要弄明白該一抗能夠識(shí)別什么種屬的抗原，抗體說明書上面一般注明有，比如小鼠Mus, 大鼠Rat, 人Hum。再次比較重要的是要注意一抗的來源。比如我們在人的癌組織中做p53的免疫組化，一抗我們采用的是小鼠來源的p53抗體，那么二抗我們一定要選擇 抗小鼠的二抗比如（山羊抗小鼠，兔抗小鼠），這一點(diǎn)非常重要。最后，一般的抗體說明書都會(huì)注明能做什么實(shí)驗(yàn)，如果標(biāo)明了不可以做免疫組化，一定不要選擇；反過來說，即使標(biāo)明了可以做免疫組化，也不一定能夠做，商家只會(huì)夸大其效果。

d. WB和IF的二抗是一樣的嗎？

很明顯，不是！免疫熒光抗體是用于 免疫熒光試驗(yàn)的，是用FITC或PE等標(biāo)記的抗體，結(jié)果需要紫外線激發(fā)并用熒光顯微鏡觀察WB抗體一般是HRP或堿性磷酸酶等標(biāo)記的抗體，需顯色底物（如OPD\TMB等）直接顯色（肉眼）或化學(xué)發(fā)光法顯影（需特殊儀器）。

e. 做CHIP的抗體是否可以用來做WB抗體？

不一定，一般來說做CHIP級(jí)別的抗體對(duì)抗體純度特異性方面都要求比較高，基本上能做CHIP的抗體都可以做WB。但是如果CHIP的抗體識(shí)別的是構(gòu)象表位（比如是由兩個(gè)實(shí)際靠在一起但變?yōu)榫€性結(jié)構(gòu)之后相隔很遠(yuǎn)的兩端序列），而不是線性表位，這種CHIP抗體做不了WB。

f. 抗體說明書上面沒有寫該抗體能夠用于某項(xiàng)實(shí)驗(yàn)怎么辦？

一般而言，抗體研發(fā)出來之后都要經(jīng)過WB，IP，IF，IHC實(shí)驗(yàn)。檔發(fā)現(xiàn)濃度不夠做IF，IHC時(shí)候，國外的抗體一般都是寫未檢測，國內(nèi)的抗體一般是不寫。所以盡量不要抱著試試的心里去嘗試，往往只會(huì)浪費(fèi)時(shí)間。你想啊，如果抗體能夠做該實(shí)驗(yàn)，他們肯定會(huì)寫上去啊。

g. 做ELISA的抗體能否用來做WB？

通常用WB抗體稀釋濃度為1:1000，IF/IHC為1:100，而如果可以做ELISA則可以稀釋1:10000。如果一個(gè)抗體用來做ELISA的，那么言外之意就是該抗體效價(jià)不高。但不是說ELISA的抗體不能用于做WB，抗體說明書提示做ELISA稀釋比例為1:1000，那么你可以試試1:100做做WB。